Itachi nació dentro del Clan Uchiha, es el hijo mayor del líder del clan Fugaku Uchiha y de su esposa Mikoto Uchiha. Él siempre fue considerado y elogiado como el mejor en su generación, un genio por encima de todos los demás. Incluso sobrepasaba las expectativas de un miembro experto del Clan Uchiha. Sin embargo, ni siquiera su familia, amigos o profesores lo podían entender. Cuando sólo tenía cuatro años, Itachi ya había sido testigo de la pérdida de muchas vidas debido a la Tercera Guerra Mundial Shinobi, que emocionalmente lo traumatizó y lo convirtió en un pacifista. A los 7 años, se graduó de la Academia Ninja como el primero en su clase después de sólo un año por aquel entonces comenzó a sentir interés por el origen de la aldea, dominó el Sharingan a la edad de ocho años y pasó los exámenes Chūnin a los 10 años, y se convirtió en capitán de las unidades ANBU a los 13 años.
Itachi en sus tiempos de ANBU.
Él fue muy elogiado por su padre, que veía el futuro de la familia en Itachi, por lo que descuidó a su hijo menor, Sasuke Uchiha. Sin embargo, durante este tiempo Itachi mostró gran afecto hacia su hermano pequeño, e incluso animó a su padre para venir a la ceremonia de Inscripción de Sasuke a la Academia, algo que su padre había olvidado diciendo que tenía una importante misión para establecer a Itachi a las filas ANBU.
Cuando el Clan Uchiha comenzó a planear el derrocamiento de Konoha, Itachi, como ANBU, recibió el encargo de espiar a la aldea. Sabiendo que un golpe de Estado sólo conduciría a una nueva guerra ninja, Itachi comenzó a espiar a los Uchiha en su lugar, transmitiéndole información alTercer Hokage y a los otros ancianos de Konoha. Durante este tiempo él comenzó a actuar de forma extraña, ya que no asistía a las reuniones del clan, hablando en contra del clan y además era considerado el principal sospechoso por el asesinato de su mejor amigo, Shisui Uchiha, que se ahogó en el Río Nakano. Debido a esto, el clan había perdido sus esperanzas en Itachi, y su padre comenzó a cambiar su enfoque a Sasuke en su lugar. Mientras tanto, los intentos del Tercer Hokage de negociar un final pacífico de las hostilidades entre las dos partes están resultando ineficaces; así, contra los deseos del Tercero, Danzo Shimura y el Consejo de Konoha le ordenó a Itachi acabar y exterminar a todo el Clan Uchiha.
Itachi matando a los miembros de su clan.
Sasuke intento atacarlo por lo que despierta su Sharingan por primera vez, pero Itachi logro esquivar sus ataques. Cuando Itachi estaba recogiendo su Banda Ninja la cual se le había caído, él derrama una lágrima frente a su hermano. Luego procedió a incapacitar a Sasuke, quien despertó en el hospital recordando todo lo que quería que él hiciera. Desde ese momento Sasuke juro vengarse de él y poder re-establecer la gloria del Clan Uchiha. Itachi dejó el pueblo como un traidor. Según Tobi, Itachi también tenía una novia, a quien mató durante la Masacre del Clan Uchiha.

Itachi hablando con el Tercer Hokage.

Itachi entra a Akatsuki.
Itachi se asoció con Kisame Hoshigaki, que en un principio recibió amenazas después de que éste trató de intimidarlo. Sin embargo, finalmente se convirtieron en buenos socios para compartir el vínculo común de haber traicionado a las personas más cercanas a ellos. En algún momento después de unirse a Akatsuki y que Orochimaru huyera, Itachi ayudó a reclutar aDeidara a golpes en una batalla utilizando sólo genjutsu, a la que Deidara juró venganza contra Itachi, incluso entrenó su ojo y su jutsu para vencerlo.
En algún momento, Itachi contrajo una enfermedad mortal. Se mantenía vivo a través de diversos medicamentos y pura "fuerza de voluntad", con la esperanza de vivir lo suficiente para morir a manos deSasuke. De esta enfermedad no se supo hasta que Tobi la mencionó pues en sus apariciones en la serie no mostró ningún síntoma, exceptuando la pelea con Sasuke.
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